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島津成像質(zhì)譜顯微鏡應(yīng)用專題

時間:2021-01-26 18:07來源:金利儀器 作者:金利儀器 點擊:
黑腹果蠅(以下簡稱果蠅)是一種被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個領(lǐng)域的模型動物。作為一種模型動物,果蠅有很多優(yōu)點,比如,它的生命周期短,只有10天左右,它的基因重組技術(shù)已得到確定,培育和創(chuàng)建新模型的成本不高,而且從動物倫理學(xué)角度來看,不存在任何問題。由
  

黑腹果蠅(以下簡稱果蠅)是一種被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個領(lǐng)域的模型動物。作為一種模型動物,果蠅有很多優(yōu)點,比如,它的生命周期短,只有10天左右,它的基因重組技術(shù)已得到確定,培育和創(chuàng)建新模型的成本不高,而且從動物倫理學(xué)角度來看,不存在任何問題。由于研究人員已經(jīng)掌握與果蠅相關(guān)的遺傳知識和基因重組技術(shù),因此可將其廣泛用作模型生物,用于研究阿爾茨海默癥、帕金森病和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等神經(jīng)退行性疾病(1)。

 
神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)退行性疾病中扮演重要角色。舉例來說,眾所周知,γ-氨基丁酸(GABA)作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),對各種生物行為和神經(jīng)退行性疾病都產(chǎn)生影響(2)。
 
為了確定GABA在大腦中的功能,不僅需要研究大腦中的GABA濃度,還需要研究其空間定位。因此,我們認(rèn)為了解GABA在果蠅頭部的位置信息,對于理解GABA在各種疾病模型中所起的作用至關(guān)重要。
 
雖然研究人員已采用免疫組織化學(xué)染色和熒光標(biāo)記成像技術(shù)來研究GABA在果蠅頭部的空間定位信息,但這些傳統(tǒng)方法主要通過觀察GABA合成酶GAD1(3)或GABA轉(zhuǎn)運體(4)而間接分析GABA的分布。因此,近年來基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像(MALDI-MSI)法,作為一種直接檢測目標(biāo)分子的技術(shù),在非哺乳動物模型生物體生物分子的可視化分析中備受關(guān)注。
 
圖1顯示了MALDI-MSI的工作流程。使用此方法時,首先對樣品材料進(jìn)行切片,通過激光照射,用離子化輔助劑(基質(zhì))對樣品切片中的分子進(jìn)行解吸和電離,然后用質(zhì)譜檢測這些分子。在組織上連續(xù)進(jìn)行激光照射,得到的系列解吸/電離后的離子并進(jìn)行質(zhì)譜檢測,并通過提取質(zhì)譜圖中m/z強(qiáng)度信息并結(jié)合位置信息,獲取顯示分子空間分布的二維圖像。由于MALDI-MSI通常不需要熒光標(biāo)記或其他可視化標(biāo)簽,且分子本身離子化后可被質(zhì)譜檢測,因此該項技術(shù)被認(rèn)為對直接觀察成年果蠅頭部的GABA有所幫助。在以前的研究中,其他研究小組通過使用MALDI-MSI 成功實現(xiàn)對小鼠大腦中的GABA進(jìn)行可視化分析(5)。
 
然而,到目前為止,MALDI-MSI應(yīng)用于成年果蠅頭部GABA可視化分析還存在一些困難。首先,對于通過福爾馬林固定法和石蠟包埋法(FFPE)等方法固定的樣本,進(jìn)行MALDI-MSI分析很困難,因為GABA等小分子代謝物在脫蠟過程中容易被沖洗掉。而且,由于果蠅頭部非常小(≤1mm3),很難制備MALDI-MSI分析中常用的冷凍切片(6)。除了樣本大小問題之外,果蠅頭部還覆蓋有堅硬的角質(zhì)層。這些堅硬的角質(zhì)層中的腦細(xì)胞沒有中間絲,而且由于這些腦細(xì)胞相對于哺乳動物的腦細(xì)胞更加柔軟,因此,果蠅頭部和大腦的硬度有很大的差異。
 
基于以上特征,在保持成年果蠅頭部形態(tài)的同時制備其切片非常困難。Cryo-tape冷凍切片膠帶(Leica)通常被用于制備這類樣本的切片。然而,市售冷凍切片膠帶包含一層非導(dǎo)電膜,放置在此類材料支撐介質(zhì)上樣品,其表面的離子強(qiáng)度會被極大降低。造成這種現(xiàn)象的原因被認(rèn)為是由于絕緣體的存在和樣品板上的電場擾動,導(dǎo)致樣品表面帶電所引起。
 
此外,MALDI方法對GABA的離子化效率很低,且果蠅頭部的GABA含量相對比哺乳動物少,這通過它們腦部相對大小的差異便可想象。這也是直接可視化分析果蠅大腦中GABA分布的難點。因此,即使可以對嚙齒類動物大腦中的GABA進(jìn)行直接離子化和MALDI-MSI分析,仍不清楚是否可以在果蠅頭部檢測到GABA。
 
本應(yīng)用報告介紹了我們小組之前發(fā)表的可視化分析果蠅腦部GABA空間分布的內(nèi)容(7)。我們研究了解決上述果蠅腦部切片制備難題的方法并直接獲取組織切片,優(yōu)化了原位組織衍生化方法以提高GABA的離子化效率。此外,本文還概述了當(dāng)前原位組織衍生化方法,包括其顯著特點。
 
 
 
(責(zé)任編輯:金利儀器lyh)
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